*.反义寡核苷酸技术 https://www.docin.com/p-945363074.html
原创 凯莱英医药 凯莱英药闻 2021-03-23 17:53
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新冠疫情将mRNA技术带入大众视野，而同属小核酸药物的反义寡核苷酸（antisense oligonucleotides，ASO）在mRNA火爆之前就已获得成功。反义寡核苷酸是一种单链寡核苷酸分子，通常包含15-25个核苷酸。其进入细胞后在核糖核酸酶H1的作用下通过碱基互补配对原则与其互补的靶mRNA结合，抑制靶基因的表达。
目前，ASO药物已有8款获批上市。其中，治疗治疗脊髓性肌萎缩（SMA）的Nusinersen于2016年上市，全球销售额在2020年达到21亿美元。
Fomivirsen由Inois和诺华合作研发，于1998年获FDA批准上市，治疗巨细胞病毒视网膜炎（CMV），是第一个获批上市的反义寡核苷酸药物。虽然Fomivirsen是第一个上市的反义寡核苷酸药物，但在市场方面并未获得相应的成功。由于高活性抗逆转录病毒疗法（HAART）的发展，CMV病例数急剧减少。诺华分别于2002年和2006年，在欧洲和美国停止销售该药。直到2013年，治疗纯合性家族性高胆固醇血症(hoFH)的Mipomersen上市，反义寡核苷酸药物再次迎来生机。Nusinersen则是反义寡核苷酸药物中的明星产品，作为罕见病用药，Nusinersen的价格惊人，一剂药价格约12.5万美元，一年治疗费用约75万美元。但高昂的价格并未阻止Nusinersen受欢迎程度，2019年2月登录中国，从提交上市申请到上市仅耗时不到6个月。目前，Nusinersen已在全球50多个国家和地区上市，2020年销量达到21亿美元。
Inois作为反义寡核苷酸药物领域的龙头，在技术方面拥有绝对优势，其MOE修饰技术和配体欧联抗敏技术等在全球主要市场美国、欧盟、日本已形成高度的专利壁垒，目前在研临床阶段产品大多出自Inois。
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扫描下方二维码，欢迎关注凯莱英药闻。参考资料1.Neurotherapeutics (2013) 10:486–497.2.FDA、Inois官网
3.clinicaltrials.gov
全球第一款siRNA药物patisiran
原创 TiPLab木山 TiPLab 2020-01-31 07:00
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2018年10月，全球第一款RNAi药物patisiran(商品名：onpattro®)获得FDA批准上市，用于治疗遗传性甲状腺素介导的淀粉样变性的多发性神经病。这次onpattro®获批，不仅解决了RNAi疗法应用的最大障碍，实现了人体内RNAi疗法的靶向递送，也开创了遗传性甲状腺素介导的淀粉样变性的多发性神经病的新疗法。全球第一款siRNA药物patisiran
byTiPLab 木山▼
全球第一款RNAi药物patisiran
研究表明，将与mRNA对应的正义链和反义链组成的双链RNA(double stranded RNA，dsRNA)导入细胞，可以使信使RNA(mRNA)发生特异性的降解，导致其相应的基因沉默，不表达相应蛋白。这种转录后的基因沉默机制被称为RNA干扰(RNA interference，RNAi)。
遗传性甲状腺素介导的淀粉样变性的多发性神经病(hereditary transthyretin-mediated amyloidosis，hATTR)是由基因突变引起的，这种突变会影响体内运甲状腺素蛋白(transthyretin，TTR)的功能。TTR蛋白主要在肝脏中产生，是维生素A的载体。当TTR发生突变时，人体内会积累异常的淀粉样TTR(TTR amyloid，ATTR)，对人体器官和组织(如周围神经和心脏等)造成损伤，引发难以治疗的外周感觉神经病变、自主神经病变或心肌病。
Patisiran是一种包含19个碱基对的双链小干扰性核糖核酸(small interfering ribonucleic acid，siRNA)，可被配制成脂质纳米复合物后递送至肝细胞。Patisiran能够与TTR的mRNA的基因保守序列特异性结合，因此能够特异性沉默TTR的表达，抑制TTR蛋白的产生，从而减少周围神经中淀粉样沉积物的积累，避免器官和组织损伤。
参见Alnylam官方网站
参见onpattro® FDA说明书▼
脂质纳米颗粒给药系统解决了RNAi药物的给药问题
斯坦福大学的Andrew Fire教授和马萨诸塞大学的Craig Mello教授因为发现RNAi机制而共享2006年的诺贝尔奖。而在那之前，人们便已经开始尝试在哺乳动物细胞中通过RNAi机制抑制致病蛋白的表达，从而治疗相关疾病。
然而，因为体内应用siRNA分子治疗疾病存在稳定性差(易被核酸酶降解)、易被肝肾清除、存在免疫原性、难以穿过细胞膜被靶细胞摄取及难以从细胞内体中逃逸等问题，一直没有一款RNAi药物研发成功并上市。令人兴奋的是，在2010年，Alnylam公司发表了一篇文章称其开发出了一种安全有效的*脂质纳米颗粒(Lipid nanoparticles，LNP)给药系统，能够对RNAi药物进行靶向递送，解决了实现RNAi疗法最大的问题。
参见Zatsepin T S, Kotelevtsev Y V, Koteliansky V. Lipid nanoparticles for targeted siRNA delivery–going from bench to bedside[J]. International journal of nanomedicine, 2016, 11: 3077.
LNP系统是一类含有膜脂的脂质双层结构。研究表明，用含离子型阳离子脂质的LNP系统囊化siRNA分子给药后，LNP-siRNA系统通过吸附内源性的载脂蛋白E(Apolipoprotein E，ApoE)，可以触发肝细胞表面的ApoE受体摄取，进入肝脏细胞，导致与siRNA相应的基因沉默。
LNP系统可通过阳离子脂质1，2-二羟基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-DMA，一种含有亚油酸酰基链的DODAP醚类似物)制备，而且研究发现LNP的功能活性与所用阳离子脂种类特别相关。
通过鉴定及优化囊化siRNA分子后LNP在生物体内的活性，得到了一种名为MC3的脂，即二油甲基-4-二甲基氨基丁酸酯。他们发现，用MC3制备siRNA/LNP给药系统(DLin-MC3-DMA)，与单用DLin-DMA相比，肝脏组织细胞内的基因沉默活性提高三个数量级。▼
围绕LNP系统的专利申请策略
2010年6月10日，Alnylam公司以美国临时申请US61/185,800和US61/244,834为优先权，分别递交了涉及一种脂质制剂的PCT专利申请——PCT/US2010/038224，以及美国专利申请US12/813,448(其授权专利号为US8158601B2)。
接下来我们从中国和美国的专利申请情况简单分析下其专利申请的特点。PCT/US2010/038224进入中国的授权专利为CN102625696B，权利要求1保护了一种阳离子脂质，限定其化学式，权利要求2保护包含权利要求1所述阳离子脂质的脂质制剂。
在CN102625696B的基础上，Alnylam公司递交了一个分案申请，其授权专利号为CN104873464B：CN104873464B保护了一种核酸-脂质颗粒，包含脂质颗粒以及封装在脂质颗粒中的治疗性siRNA。
其美国同族US8158601B2同样保护了这种阳离子脂质，不过受益于美国专利审查制度中的专利期补偿机制，其专利有效期调整延长了153天；
在US8158601B2基础上，Alnylam继续递交了一系列延续申请，其中US8802644B2保护了一种核酸-脂质颗粒，其专利有效期获得了133天的延长。
我们发现，Alnylam在中国和美国的专利申请采取了类似的专利布局结构：
由母案保护重要的脂质制剂的活性成分，分案保护脂质制剂与治疗性siRNA的组合。
这种多层次的申请一方面会对竞争对手的商业行为造成更多专利壁垒；另一方面，由于美国专利申请存在专利期限调整的制度，多重专利申请在一定程度上也有可能获取不同的延长期限，以延长专利对产品的保护期限。▼
围绕patisiran的专利申请策略
涵盖dsRNA和其脂质制剂的专利家族
Alnylam公司解决了RNAi药物在给药技术上的难题后，将脂质纳米颗粒给药系统与治疗技术相结合，针对hATTR进行研发得到全球第一款获批的RNAi药物onpattro®，其活性成分为patisiran。为了更好地保护相应的产品，Alnylam针对onpattro®也从活性成分dsRNA及dsRNA与脂质颗粒结合的脂质制剂两方面递交了不同的专利申请。
2009年10月20日，Alnylam公司以美国临时申请US61/106,956、US61/115,738、US61/156,670、US61/185,545、US61/242,783、US61/244,794为优先权，递交了涉及靶向运甲状腺素蛋白(TTR)基因的双链核糖核酸(double stranded RNA，dsRNA)的专利申请——PCT/US2009/061381。
PCT/US2009/061381进入中国的授权专利为CN102186978B，其权利要求1保护了一种用于抑制运甲状腺素蛋白表达的dsRNA，并限定了其反义链与TTR的mRNA互补区域的核苷酸长度、反义链包含的序列等。经过比对发现，该专利保护范围涵盖patisiran的活性成分。
在CN102186978B的基础上，Alnylam公司递交了多个分案申请，其中：CN103937793B保护了抑制运甲状腺素蛋白表达的组合物，包含抑制TTR表达的dsRNA与特定脂质的制剂，不仅限定了该脂质的化学式，也限定了dsRNA含有与TTR的mRNA互补的反义链区域的核苷酸长度、反义链包含的序列等。其中该脂质的化学式与上文CN102625696B中涉及的阳离子脂质相吻合。
CN102186978B的另一个分案申请CN106834291A涉及抑制TTR表达的组合物，同样包含抑制TTR表达的dsRNA与限定化学式的脂质制剂，但限定dsRNA的反义链与具体序列SEQ ID:1331的核苷酸618-648的15-30个核苷酸互补，和SEQ ID:1331核苷酸628上的鸟嘌呤碱基配对。从目前权利要求描述来看，对dsRNA的范围限定更加宽泛。
关于patisiran的活性成分专利家族，其在中国的专利申请母案保护了核心的活性成分dsRNA，而两个分案均在dsRNA结合MC3脂质制剂的基础上，对dsRNA做了不同的限定。母案与分案从不同角度保护其活性成分，增加了其产品专利的稳定性。
医药用途专利家族
2015年8月27日，Alnylam公司以美国临时申请US62/044,100、US62/150,596为优先权，递交了涉及运甲状腺素蛋白(TTR)介导的淀粉样变性的治疗方法的专利申请——PCT/US2015/047185。
PCT/US2015/047185进入美国的授权专利为US10060921B2，权利要求1保护了一种治疗hATTR患者的方法，该方法包括向该患者给药一定剂量的patisiran和相应制剂，并限定了其具体给药方案。
PCT/US2015/047185进入中国的专利申请为CN107106874A，权利要求1涉及一种减少TTR相关失调患者神经病变损伤评分的方法，包括向患者提供TTR抑制组合物，将其血清TTR浓度降低到一定程度。
涉及patisiran的医药用途专利家族申请时间晚于活性成分专利家族，因此等到其活性成分专利家族失效时，其医药用途专利家族仍能够在一定时间内阻止对手生产活性成分相同的产品在相应的适应症市场上与其竞争，从另一个角度延长了专利保护产品的期限。▼
不同层次的专利申请从多角度保护企业的核心技术与产品
我们可以看到，Alnylam关于核心技术与产品的专利保护通常是多层次的。这样多层次的专利布局能够建立层层壁垒，通常会给竞争对手设置更多障碍：
一方面，多重的专利保护会增加对手的侵权风险或对专利进行无效的难度；
另一方面，不同的专利家族从活性成分、医药用途等不同角度保护产品，其申请时间不同，也能在一定程度上延长相关产品的专利生命期限。
这种多重的专利申请能够对企业的核心技术与产品做出更严密的保护，增加其竞争对手侵权的风险，但同时也会要求企业在知识产权上投入一定的预算，因此具体怎样的专利布局对企业最有利，就需要企业结合自身情况去权衡选择了。
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Nature：反义寡核苷酸药物（ASO）综述与展望
原创 Armstrong 医药笔记 2021-03-26 08:58
▎Armstrong2021年3月24日，Nature Reviews Drug Discovery期刊发表了Ionis公司科学家关于反义寡核苷酸药物（ASO）的综述文章。
反义寡核苷酸药物的发展可谓迅速，1978年ASO技术出现，20年后的1998年首款ASO药物获得FDA批准。到今天，ASO领域已经涌现多种新技术，并有多款药物获得FDA批准。
下表列举了FDA批准的9款ASO药物。
下图展示了ASO可以靶向起作用的环节。
ASO的药物化学已经有许多新发展。
下图所示为ASO杂交后的作用机制。
下图为硫代磷酸ASO药物毒性的分子机制。
下图所示为ASO药物局部给药的各种策略。
下图所示为rNase H1或Ago2介导的RNA降解过程。
下表为ASO药物经验证的各种给药途径。下表为治疗神经系统和肌肉疾病的在研ASO药物。
的
下表为治疗眼病、癌症等的在研ASO药物。
总结反义寡核苷酸药物近年来发展迅速，国内方面瑞博生物进入发展快车道，2015年成立以来累计完成超10亿元融资。2020年12月，瑞博生物递表科创板IPO招股书，最新估值36亿元。